Bioinsecticida

Producción de bioinsecticida a base de bacillus thuringiensis; Minirevisión


Resumen
Introducción
Aspectos generales de bacillus thuringiensis
Mecanismo de acción de la delta-endotoxina
Aspectos relacionados con la producción de bth
Referencias

RESUMEN

La bacteria Bacillus thuringiensis (Bth), es un bacilo gram-positivo que produce durante la esporulación un cristal de proteína tóxico para insectos plaga conocido también como delta-endotoxina, el objetivo del presente trabajo fue realizar una breve revisión sobre algunos aspectos relacionados con la producción del bioinsecticida a base de Bth, que involucra el diseño de medios de cultivo con materia prima barata, que aumenten la calidad tóxica de los cristales y por tanto mejoren la calidad bioinsecticida para el control de insectos-plaga.

Palabras clave : Bacillus thuringiensis, delta-endotoxina, substratos baratos, cristales, toxicidad, bioensayo.

INTRODUCCION

Las plagas tanto urbanas como rurales son una amenaza constante para la salud y la calidad de vida humana (Dulmage, et al., l990), son también la causa de pérdidas económicas; como en el caso del tabaco, afectado mundialmente por el insecto Lasioderma serricorne lo que disminuye su valor comercial (Kaelin , et al., l994).Hasta ahora la única forma eficaz de controlar estos insectos plaga se basa en la aplicación de pesticidas químicos, aunque ello trae en consecuencia problemas ecológicos; por tanto el uso irracional de los agroquímicos ha sido causa de contaminación ambiental, en especial a finales de la segunda guerra mundial con el surgimiento de plaguicidas de origen órgano-sintético, que al desequilibrar el balance ecológico, han disminuido la biodiversidad, mientras que sus residuos tóxicos han contaminado los alimentos e inducido resistencia en los insectos plaga (Dulmage. et al., l990 ; Karamanlidou, et al., l991 y Badii, et al., l996),en la actualidad 500 insectos son resistentes a uno o mas pesticidas y el numero puede aumentar notablemente en pocos años (Rowe y Margaritis, 1987 citados por Macías, 1995). Una posible alternativa para solucionar este problema es el control biológico, definido como el uso de un organismo natural o modificado genéticamente y/o sus productos para reducir los efectos de insectos plaga (Galán et al., l996). Ignoffo y Hink , citados por Badii en l996 , reportan la existencia de más de 1500 especies de microorganismos entomopatógenos con potencial para el control microbiano de insectos, en relación a su diversidad se señalan: hongos, virus, protozoarios y bacterias , en donde las últimas son las de mayor importancia. De las bacterias la más sobresaliente pertenece al género Bacillus. Falcón citado por Badii en 1996, clasificó a las bacterias en dos grupos a) las esporuladas y b) las no esporuladas. En donde las bacterias entomotóxicas con mayor potencial para la producción de bioinsecticida es Bacillus thuringiensis (Bth), la que más se ha explotado comercialmente, mientras que en segundo lugar se ubica a B. popillae y más recientemente B. sphaericus y B. morati que tiene valor reconocido en el control de plagas urbanas como los mosquitos, vectores de paludismo, dengue, etc. (Badii, et al., 1996).

ASPECTOS GENERALES DE Bacillus thuringiensis

La bacteria Bacillus thuringiensis (Bth) es un bacilo gram-positivo, flagelado y esporulado que se caracteriza por la formación de un cuerpo paraesporal o cristal de proteína, conocido como delta-endotoxina, estos cristales se forman durante la esporulación y tienen actividad tóxica para larvas de insectos (Shieh, l988). A Bth se le considera cosmopolita, pues sus esporas se han aislado de suelo (Meadows, et al., l992) , de larvas de insectos enfermos (Kaelin P., et al., 1994), de productos almacenados (Karamanlidou, et al., 1991), y hojas de arboles (Meadows, et al., 1992; Sanchez-Yáñez y Peña-Cabriales, 1995), aunque es más frecuente aislarla de productos almacenados, pues las condiciones ambientales del almacén permiten la persistencia de sus esporas (Martinez y Sánchez- Yáñez,1998) incluyendo la rizosfera de plantas (Medrano, et al., 1998).

La delta-endotoxina puede variar en tamaño y en forma, ya que según la variedad de Bth, pueden producir en el medio de cultivo más de una forma de cristales ; Kaelin et al., l994, mencionan que encontraron cristales de formas romboidal (de proteínas de 65 kDa), de tipo amorfo entre (130 y 140 kDa) y heterogéneo (de aproximadamente 63 kDa) y también de la clase bipiramidal (l30 y 65 kDa ) . Mientras Karamanlidou, et al., 1991, reportan el aislamiento de cristales irregulares, cuboidales, bipiramidales y esféricos, aunque Meadows, et al., 1992, señalan que la forma más común es la bipiramidal. Mientras que Kaelin, et al., l994, proponen una forma de clasificación de los cristales más práctica en base a su espectro de actividad insecticida, en donde los cristales tipo Cry I son tóxicos

para lepidópteros, los Cry II para lepidópteros y dípteros, los tipo Cry III para coleópteros y

los Cry IV para dípteros.

MECANISMO DE ACCION DE LA DELTA-ENDOTOXINA

Cuando el cristal es ingerido por un insecto susceptible en fase larvaria llega a su intestino medio, se disuelve por la acción de los jugos intestinales a pH alcalino, aquí la delta-endotoxina sufre una proteolisis enzimática y da origen a la toxina activa, la cual se une a un receptor específico de las membranas epiteliales de las células del intestino, lo que genera poros que desequilibran su balance osmótico y provocan la lisis celular de esta parte

del aparato digestivo, posteriormente causa diarrea y vómitos en el insecto, lo que puede

provocar eventualmente su muerte por una deshidratación severa (Hugutte,l989, citado por

Leal 1995; Shieh, 1988).

ASPECTOS RELACIONADOS CON LA PRODUCCIÓN DE Bth

La selección de un aislado silvestre de Bth y su capacidad efectiva para producir cristales tóxicos y posible manipulación genética para mejorarla, al igual que sus requerimientos nutricionales, son aspectos fundamentales en la producción del bioinsecticida a base de esta bacteria; una etapa clave en el proceso de escalonamiento masivo para la producción de la delta-endotoxina, y su posterior formulación y aplicación a nivel de campo (Reicheldelfer, 1981). Por lo que es necesario un diseño adecuado de un medio de cultivo (o de fermentación) apto para el crecimiento, esporulación y formación de los cristales de Bth (Galán, et al., 1996), pues de ello depende la calidad tóxica del cristal; en ese sentido el medio de fermentación debe contener una fuente de carbono, de nitrógeno orgánico y sales minerales que en balance estimulen el crecimiento, la esporulación y la producción de cristales altamente tóxicos. En términos del tipo de constituyentes, la fuente de carbono (C) orgánica más empleadas son: la glucosa, el almidón y secarosa, reconocidas como esenciales para la síntesis de cristales, aunque Couch y Ross en 1980, al utilizar como fuente de C materias primas baratas, como productos de maíz hidrolizado (almidón y dextrinas), al igual que Murga en 1983 jugo de agave y melaza de caña (fructosa), excelentes resultados sobre la esporulación y calidad tóxica del cristal. Cabe mencionar que

la melaza de caña se considera una materia prima adecuada como fuente de C, de bajo costo con efectos positivos sobre la toxicidad de la delta-endotoxina (Aronson, et al.,1971). Es claro que la ausencia de una fuente adecuada de C para Bth, causa una disminución en la producción de esporas y en la formación y calidad de la deltaendotoxina.

En el caso de fuentes de Nitrógeno (N) : Se ha reportado que Bth requiere de aminoácidos esenciales y otras formas orgánicas de nitrógeno durante su fase de crecimiento y durante la esporulación (Galán, et al., 1996), en general en los medios de cultivo comerciales se han empleado proteínas de semilla y/o agua de cocimiento de maíz, otras alternativas más baratas han sido obtenidas de fuentes naturales como la harina de pescado, de la semilla de algodón, o de leguminosas como la soya, el garbanzo, la haba, el cacahuate y las lentejas, o bien de líquido de remojo de maíz; de residuos de levadura, de sangre de res, del suero de queso y productos secundarios de la industria láctea, esta clase de materia prima estimula la biosíntesis de la delta-endotoxina con alta actividad insecticida (Couch y Ross, 1980; Salama, et al., 1983). Para los minerales se ha señalado al Mn+2, K+1, Ca+2 y Zn+2 como elementos componentes necesarios en el medio de fermentación para la producción de la delta-endotoxina (Galán, et al., 1996). Dulmage (1970), reportó el aislamiento de un Bth que en un medio que contiene dextrosa, extracto de levadura K2HPO4 y KH2PO4 presentó los mejores niveles en la producción de la delta-endotoxina y recomiendò el uso de substratos baratos como harina de semilla de algodón y harina de soya; Goldberg (1980) describió un medio de fermentación con glucosa, peptona de soya, extracto de levadura y líquido de remojo de maíz y sales minerales del tipo: KCl, (NH4 )2 SO4 , H PO4 , Mg SO4 , CuCl2 , FeSO4, ZnSO4 y MnSO4 , con el que logró un alto rendimiento en la esporulación y cristales tóxicos de excelente calidad. Por lo anterior, los medios de cultivo para Bth deben contener sales minerales para la síntesis de energía, estimular el crecimiento y la esporulación, y factores de crecimiento como: extracto de levadura (como una fuente de vitaminas del complejo B), pues su omisión retarda la esporulación y reduce la formación de cristales y en consecuencia la toxicidad del complejo espora/cristal (Dulmage, 1981). Goldberg, en 1980, observó un claro incremento en la producción de esporas al adicionar extracto de levadura a un medio de cultivo enriquecido (mencionado anteriormente). Para Bth , la combinación de factores nutricionales orgánicos e inorgánicos es esencial en la síntesis de la delta-endotoxina de alta toxicidad, así que el uso de materiales de bajo costo como componentes del medio de cultivo, es básico en la optimización del proceso de producción bioinsecticidas a base de Bth. En consecuencia para el diseño de medios de cultivo o fermentación sugiere 1) que sus componentes sean fácil de manejar o que no requieran pretratamiento; 2) que permitan optimizar el crecimiento de la bacteria sin afectar negativamente la calidad de la delta-endotoxina; 3) que sean baratos y abundantes (Dharmsthini, et al., 1985) y 4) y sean de fácil adquisición en la localidad (Dulmage H.T., l990). Es importante señalar que una formula basada en la combinación de nutrientes para una variedad de Bth, no necesariamente es adecuada para otra variedad, por lo que la calidad de la delta-endotoxina depende tanto del medio de cultivo como del aislado de Bth utilizado (Dulmage, 1970). Aunque obviamente, el diseño del medio y la bacteria no son los únicos aspectos involucrados en la producción del bioinsecticida, existen otras variables que deben considerarse en el proceso de la fermentación como: la temperatura óptima de crecimiento de Bth oscila entre los 28 y 32ºC; la cantidad de oxigeno suministrado a la bacteria, la velocidad de agitación para asegurar un suministro de oxigeno adecuado en el medio de cultivo y evitar la acumulación del calor y evitar la inhibición o reducción de la calidad tóxica de los cristales; así como el pH inicial óptimo de entre 6.8-7.2 (Galán, et al., 1996), ya que al oxidar los carbohidratos produce ácidos orgánicos, lo que se soluciona con neutralización con álcali (Dulmage, et al., 1990). En síntesis en la tabla 1 se presentan algunos de los substratos o materias baratas que se pueden utilizar en la formulación de medios de cultivo adecuados para la producción de la delta-endotoxina a base de Bth..



Modificada de Dulmage 1990. * Probados con excelentes resultados. El resto no lo han

sido o sin resultados aceptables, pero pueden ser útiles en combinación con otros substratos.

Hasta ahora se ha abordado el tema de la fermentación a nivel de laboratorio, pero para la producción del bioinsecticida a una escala mayor es necesario un proceso de escalonamiento. El escalonamiento se define como el conjunto de técnicas y métodos empleados para transferir a una escala mayor (escalamiento ascendente) o menor (escalamiento descendente) un microorganismo o un producto biológico como la deltaendotoxina y, determinar su factibilidad económica en un proceso industrial. En el

escalamiento se requiere el uso combinado e integrado de métodos y principios de ingeniería química, bioquímica, microbiología y genética ( Blakebrought y Moresi, 1981 ;

Jain y Buckland, 1988). Los estudios de laboratorio y de planta piloto son útiles para definir las operaciones unitarias de mayor importancia en el proceso de escalamiento, como en el caso del bioinsecticida a base de Bth, en donde el diseño del medio de cultivo es esencial en la optimización de la producción del complejo espora-cristal, también es necesario un diseño experimental a nivel de fermentador, el cual en función de su capacidad, el equipo instalado y los recursos disponibles, hará posibles la obtención de altamente cristales tóxicos de Bth. (Medrano y Galán, 1996).

En conclusión, la síntesis de bioinsecticidas a base de Bacillus thuringiensis, es un proceso que requiere de medios de fermentación o de cultivo elaborados con materias primas de bajo costo, paro que no afecte su calidad tóxica; el diseño de un medio de cultivo para la síntesis de la delta-endotoxina se logra mediante la combinación inteligente de fuente de carbono, nitrógeno y minerales, este medio de cultivo no necesariamente será el mismo para otras variedades o aislados de la bacteria, pues Bth sintetiza cristales diferentes en forma, tamaño y toxicidad, en función del medio de cultivo y la variedad utilizada. La

biotecnología para la producción de bioinsecticida es una área nueva en nuestro país, y es lógico esperar que por los problemas agrícolas y de salud pública que nos afectan, además del uso irracional de insecticidas químicos, promueven en el futuro el uso de estos productos biológicos, pues Bth tiene ventajas sobre los pesticidas químicos por su especificidad para actuar sólo sobre especies de insectos plaga, por su eficacia para eliminar aquellos insectos que ha desarrollado resistencia a los insecticidas químicos, y porque es ambientalmente seguro y de un costo de producción relativamente bajo; siempre y cuando se integren técnicas de escalamiento que aseguren una excelente cantidad y calidad de la delta-endotoxina producida.

A continuación en la Figura 1 se muestra un diagrama de flujo para la producción de Bacillus thuringiensis en un sistema común.







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Se agradece a la cordinación de investigación científica de la Universidad Michoacana de San Nicolas de Hidalgo por el apoyo a este trabajo por medio del proyecto 2.7 "producción de Bacillus thuringiensis".

Jesús García Yañez, estudiante del noveno semestre de la Escuela de Quimicofarmacobiología de la U.M.S.N.H., actualmente realiza su trabajo de tesis de licenciatura en el laboratorio de Ecología microbiana del IIQB de la U.M.S.N.H. bajo la asesoría del Dr. Juan Manuel Sánchez Yáñez.

J. García-Yañez Pasante de la Escuela de Químicofarmacobiología/UMSNH, Tzintzuntzan y Acueducto, Morelia, Mich. México



Autor:

Dr. Juan Manuel Sánchez-Yáñez

Profesor Investigador de tiempo completo Titular "C". Perfil PROMEP

Laboratorio de Microbiología Ambiental

Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas Edif. B-3

Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Michoacán, México.

syanez@zeus.umich.mx

syanez01@hotmail.com