Diagnóstico Serológico de Tuberculosis

Utilización del antígeno P32 y el antígeno SLIV, para el diagnóstico
rápido y precoz de la tuberculosis por la serología (ELISA) en el
Hospital Regional IHSS en San Pedro Sula, Honduras
Dubón J. M.*, L. Rigouts**, Portaels Franqoise*
RESUMEN
Hemos examinado 148 muestras de suero provenientes
de enfermos sufriendo de tuberculosis pulmonar (examen
directo del esputo positivo) y extrapulmonar
(ganglionar). De esos mismos pacientes, la serología
VIH fue efectuada.
Según los resultados de la serología ELISA P32 y el
antígeno sulfolipídico SL IV, la sensibilidad de la prueba
donó valores muy bajos, de 48.6% para el antígeno P32
y 21.4% para el SL IV. La especificidad de la prueba fue
de 76.9% para el antígeno P32.
RESUME
Nous avons testé 148 échantillons de serums provenant
de malades atteints de tuberculose pulmonaire (examen
direct du crachat positif) et extrapulmponaire
(ganglionnaire). Parmi ees mémes patients nous avons
fait la sérologie VIH. Les résultats de la sérologie ELISA
O32 et l'antigéne sulpholipide SL TV, concernent leur
sensibilité et leur spécificité. Des valeurs tres basses ont
Patólogo Clínico y Microbiólogo Médico, Hospital Regional
IHSS, San Pedro Sula, Honduras.
Departamento de Microbiología, Instituto de Medicina
Tropical, Prince Leopold, Ambires, Bélgica.
été trouvées (sensibilité de 48.6% pour la P32 et 21.4%
pour le SL TV. La spécificité était de 76.9% pour la P32).
Palabras Claves. Antígeno Proteína P32, Antígeno
Sulfolípido IV, ELISA, VIH, Tuberculosis.
INTRODUCCIÓN
Las muestras que hemos examinado fueron provenientes
de enfermos sufriendo de tuberculosis pulmonar o
extrapulmonar (ganglionar diagnosticada por la
clínica de neumología y el laboratorio (examen
directo de esputo o biopsia), en el hospital del Seguro
Social en San Pedro Sula. Esta es la segunda ciudad
de Honduras, donde la incidencia de la tuberculosis
pulmonar fue de 9 por 10,000 habitantes en 1991.m
Los resultados que hemos obtenido por la serología
utilizando como antígeno la proteína p32 puede tener
un interés para la serología de la tuberculosis, como
condición de poder aumentar la sensibilidad del examen.
Otra de las investigaciones sobre la utilización de
diferentes antígenos lipídicos (lípidos purificados de
M. tuberculosis y lípidos sintéticos) hemos también
realizado la determinación de los anticuerpos VIH por
el método de aglutinación serodia (kit comercial), en
46 REVISTA MEDICA HONDUREÑA - VOL. 61 -1993
Alguna de las muestras para hacer una comparación
entre los sujetos infectados por el virus VIH y la
serología de tuberculosis positiva.
MATERIAL Y MÉTODOS.
Material Los sueros
En el estudio todos los pacientes afectados por la tuberculosis
pulmonar y extrapulmonar, fueron casos
nuevos diagnosticados en el servicio de Neumología
del Hospital. Hemos incluido entre los controles, los
pacientes no tuberculosos pero presentando otra
patología tropical, para ver la existencia o no de
reacciones cruzadas. Los controles sanos fueron también
recolectados en el laboratorio de transfusión sanguínea
del hospital.
Todas las muestras de suero fueron enviadas en tubos
nunca a los cuales se les agregó azida de sodio al
0.01% según el método recomendado por F.
Portaels, Micobacteriología IMT enviados al Instituto de Medicina Tropical de
Amberes, Bélgica por correo. A su llegada todos
fueron guardados a -20 °C, antes de ser analizados.
Las 148 muestras de sueros pueden ser subdivididos en
4 grupos, según su procedencia, (cuadro 1).
GRUPO I.
a) 93 pacientes afectados de tuberculosis pulmonar,
VIH + = 22, VIH (-) = 30. VIH no efectuados = 41.
b) 3 pacientes afectados de tuberculosis
extrapulmonar, (ganglionar), VIH (+) = 2, VIH (-) = 1.
GRUPO II.
40 pacientes controles sanos.
GRUPO III.
12 pacientes afectados de enfermedades tropicales
como la tripanosomiasis (enfermedad de Chagas).
VIH (-).
NT = No examinados TB=tuberculoso Los
Antígenos
a) La P32, antígeno proteico ha sido purificado por J.
De Bruyn en el Instituto Pasteur de Brabant y ha
sido enviado al laboratorio de Micobacteriología
del Instituto de Medicina Tropical. Se trata de un
antígeno proteico identificado como Ag. 85 dentro
de sistema de referencia BCG (Bacilo de Calmette)
í3'1). Es purificado a partir de filtrados de cultivos
de M. bovis BCG privados de Zinc.
b) El sulfolípido SL TV es un antígeno lipídico, las
investigaciones efectuadas con los antígenos
lipidíeos han sido efectuadas con el sulfolípidos
IV, aislado del M. tuberculosis por cromatografía
efectuado por F. Papa, en el Instituto Pasteur de
París (5). Se trata del sulfato 23 diacyl trehalosa-2'
(6), su interés por el serodiagnóstico de la tubercu
losis ha sido revelado por los trabajos de Craud y
Colab. (s).
A fin de comparar la sensibilidad del ELISA-SLIV
y el ELISA P32, hemos efectuado los exámenes
utilizando los sueros positivos por ELISA P32, es
decir 14 sueros de pacientes con tuberculosis
pulmonar.
Método ELISA P32
Antígeno
El antígeno purificado en el Instituto Pasteur de Brabant
es utilizado para efectuar el coating de las placas
REVISTA MEDICA HONDUREÑA - VOL. 61 -1993
Los controles con infecciones tropicales como la
tripanosomiasis son en número de 12. Dentro de este
grupo, 10 casos son negativos a la P32, contra 2 casos
falsos positivos, sea una especificidad de 833%.
Los resultados obtenidos por los diferentes autores
sobre la investigación de anticuerpos IgG, por el
método ELISA han sido efectuados con antígenos
diferentes y sobre grupos de enfermos y controles muy
variables.
La sensibilidad del test ELISA varía de 51% a 97.5% en
función de la localización de la tuberculosis y del
antígeno utilizado. Las especificidades obtenidas por
los autores varían también de 31.8% a 100%.
En nuestro estudio hemos obtenido una sensibilidad de
47.5% por todos los tuberculosos. Los resultados parecen
ser variables, con el antígeno P32 Turneer y Col. (11) han
encontrado una sensibilidad de 63% en los infantes con
una tuberculosis pulmonar en Bélgica (11), mientras que
los resultados obtenidos en Burundi í2), 51% de
sensibilidad son comparables a los encontrados en
nuestro estudio. En las regiones de alta prevalencia, los
casos llegan en un estado avanzado de enfermedad, con
una taza muy elevada de anticuerpos. La pérdida de
sensibilidad del examen podría explicarse por una
pérdida de actividad antigénica del antígeno P32 seguido
de una mala conservación o pérdida de anticuerpos
debido a la congelación de las muestras y a la adición de
azida de sodio.
A fin de verificar la influencia del modo de conservación
de los sueros sobre la pérdida eventual de anticuerpos
antituberculosos, proponemos comparar los resultados
obtenidos con sueros conservados a + 4 °C sin azida y
los mismos sueros sin adicionarles azida. La taza de
anticuerpos será en cada caso examinada antes y después
de la congelación a - 20 °C.
La especificidad mencionada dentro de la literatura
varía de 31.8% a 100% en función del antígeno utilizado
del lugar de estudio y sobre todo de los grupos controles
utilizados, ZattayCol. (12) encontraron una especificidad
de 90%, como Kiran y Col. (13) en India y Turneer y Col.
(11) en Bélgica utilizando todos los controles de pacientes
sanos, y respectivamente los antígenos PPD y P32.
Nuestro estudio muestra una especificidad de 75%
utilizando como grupo control pacientes sanos. Por el
contrario, si se utiliza como controles sujetos sanos y
pacientes con una infección no tuberculosa, la
especificidad encontrada fue de 76.5%.
Esta investigación ha sido efectuada para conocer la
existencia de reacciones cruzadas como lo había
observado Zattlatl2). Como sabemos que a nivel de la
membrana de las bacterias, existen las proteínas de
"choque" que, cuando la bacteria se encuentra en
período de "stress", seguido a una agresión exterior,
induce la producción de anticuerpos no específicos.
TRABAJO CIENTÍFICO ORIGINAL 49
En ese caso el problema viene a ser más complicado
para el método serológico y hay que pensar en el uso de
anticuerpos monoclonales.
En nuestro estudio no observamos reacciones cruzadas
con la enfermedad de Chagas.
Por las tuberculosis pulmonares activas, Torgal y Col.
(11) que utilizan como antígeno, el glipídico fenólico
PGL-TB1, obtiene una sensibilidad de 97.5%, mientras
que Crauad y Col. m obtiene una sensibilidad de 59%
con el antígeno lipídico SL IV que es un sulfolípido.
Nuestra sensibilidad es muy baja (21.4%), comparada a
la obtenida con la P32. A primera vista pareciera que el
test ELISA SL IV sea menos sensible que el test ELISA
P32. Sería por lo tanto mucho mejor de examinar un
mayor número de sueros antes de obtener conclusiones
definitivas.
De una manera general, sería interesante analizar varias
centenas de muestras de sueros dentro de una población
muy grande. Habría también de determinar si el antígeno
P32 pierde su actividad durante un período determinado
y si la conservación y transporte 4e sueros ejercen una
influencia sobre la taza de anticuerpos IgG medidos.
La infección VIH no influye en la sensibilidad del test
ELISA P32. Estos resultados concuerdan con aquellos
obtenidos precedentemente con el Antígeno 60<8 br="" estos="">resultados son importantes porque la tuberculosis está
asociada a la infección VIH, en las regiones donde la
prevalencia de las dos infecciones es elevada.
Esta asociación debe de estar presente en los clínicos
que deberán pensar en la posibilidad de una tuberculosis
en todo paciente VIH(+) e inversamente, en una infección
VIH en todo paciente al cual un diagnóstico de tuberculosis
es efectuado. La puesta en ruta de un tratamiento
precoz, es por lo tanto más importante ya que la
enfermedad es contagiosa.
CONCLUSIONES
La sensibilidad y la especificidad han sido estudiadas
en 14 sueros provenientes de Honduras. Se trata de 93
muestras de pacientes con tuberculosis pulmonar, 3
pacientes con tuberculosis extrapulmonar(ganglionar).
12 muestras de pacientes con enfermedad de Chagas y
40 muestras de controles sanos.
El estudio de la sensibilidad con la prueba ELISA P32,
donó valores de 48.6 % para la tuberculosis pulmonar y
33% para la tuberculosis extrapulmnar. Estos dos valores
son muy bajos considerando que en el país la prevalencia
de la enfermedad es elevada.
La especificidad de la prueba ELISA P32 es de 75% para
los controles sanos, esto corresponde a los resultados
obtenidos en otros estudios, por lo tanto en nuestro
estudio, la especificidad no es influenciada por la
enfermedad de Chagas. La sensibilidad de la prueba
ELISA SL IV es muy baja (21.4%), comparada con la
encontrada con la P32 (48.6%).
Es posible que estos valores muy bajos de sensibilidad
sean debidos a una pérdida de anticuerpos unida a los
modos de conservación de los sueros. Deben de
compararse diversos modos de conservación de sueros
a fin de elucidar este problema.
Dentro de las condiciones de nuestro trabajo, la serología
de la tuberculosis no parece presentar una ventaja
comparado al diagnóstico clásico de la enfermedad por
el examen directo.
AGRADECIMIENTO
Este trabajo se llevó a cabo gracias a la colaboración de
la Fundación Padre Damien de Bruselas, Bélgica.
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Uso de la prueba de PCR para el diagnóstico de brucelosis en comunidades rurales de Nuevo León dedicadas a la producción caprina.

GACETA MÉDICA DE MÉXICO ARTÍCULO ORIGINAL
Correspondencia:
*Alberto Morales-Loredo
Universidad Autónoma de Nuevo León, UANL, CDA.
Francisco Villa s/n. Nte.
Col. Ex Hacienda El Canadá, C.P. 66054
Gral. Escobedo, N.L., México
E-mail: amorales@lcrn.mx

Fecha de recepción: 22-09-2014
Fecha de aceptación: 13-01-2015
PERMANYER
www.permanyer.com
Contents available at PubMed
www.anmm.org.mx Gac Med Mex. 2015;151:620-7
Resumen
Objetivo: Comparar la prueba PCR, para la detección de Brucella spp, en muestras de sangre humana, con respecto a rosa
de Bengala (RB), aglutinación estándar en placa (MAP), 2-mercaptoetanol (2-ME) y hemocultivo establecidas en la NOM
022-SS2-1994, en cuanto a sensibilidad y especificidad. Material y métodos: En el año 2005, se muestreó a 92 personas de
los municipios de Anáhuac y Sabinas Hidalgo, Nuevo León (N.L.), en donde se registró un brote de brucelosis en humanos.
A partir de sangre completa, se realizó el hemocultivo y se obtuvo ADN. Se amplificó un fragmento de 223 pares de bases
de la secuencia que codifica para una proteína de 31 kDa específica del género Brucella. Resultados: La PCR detectó
23 muestras positivas. La sensibilidad y especificidad de PCR comparada con RB fue de 44.68 y 95.56%, respectivamente.
Comparada con MAP fue de 51.61 y 88.52%, mientras que con 2-ME fue de 53.57 y 87.50%. Cuando se comparó con el
aislamiento bacteriano, se obtuvo un 100.0% de sensibilidad y 80.23% de especificidad considerando tanto personas
positivas como negativas para serología. Conclusiones: La prueba de PCR puede ser una herramienta alternativa al cultivo
bacteriano, en el diagnóstico de brucelosis humana.
PALABRAS CLAVE: Brucella spp. PCR. Serología.
Abstract
Objective: The aim of this study was to evaluate the sensitivity and specificity of polymerase chain reaction for detection of
Brucella spp in human blood samples compared with the serological tests and blood culture. Material and Methods: In 2005,
a total of 92 people were sampled from the towns of Anahuac and Sabinas Hidalgo, Nuevo Leon, where an outbreak of
human cases had taken place in the same year as this study. The sera collected were analyzed by serological tests according
to the NOM 022-SS2-1994. DNA was obtained using CTAB extraction method and it was used to amplify a fragment of
M.G. Álvarez-Ojeda, et al.: Comparación de pruebas para brucelosis
621
Introducción
La brucelosis es una enfermedad infecciosa producida
por bacterias del género Brucella, que se caracterizan
por ser patógenos intracelulares facultativos.
Es una clásica zoonosis (antropozoonosis) que ocasiona
problemas de salud entre los individuos que ingieren
alimentos provenientes de animales infectados
y representa un riesgo ocupacional para las personas
que trabajan o mantienen un estrecho contacto con el
ganado infectado. La enfermedad es de distribución
mundial y es endémica en algunos países, donde representa
un importante problema de salud pública1.
El control de la enfermedad en animales tiene un gran
impacto en la reducción de la incidencia en humanos2.
La incidencia de brucelosis en la población humana
de México es oscilatoria, con una variación temporal,
dependiente de la entidad. La Dirección General de
Epidemiología de la Secretaría de Salud notificó 2,073
casos confirmados en el año 2010. Los estados con
mayor incidencia fueron: Sonora con 248, Guanajuato
con 317, Jalisco con 179, N.L. con 154 y Michoacán
con 145 casos3. Del año 2000 al 2009, los registros
de nuevos casos de brucelosis en humanos, a nivel
nacional, muestran cómo la tasa de incidencia de 1.66
reportada en 2006 se incrementó a 2.38/100,000 habitantes
en 20103.
En países como el nuestro, el riesgo de adquirir la
infección en el humano está en correlación con los hábitos
higiénicos y alimenticios. La movilización de lácteos
hacia las zonas urbanas, como parte del proceso de
comercialización, ha contribuido en buena medida a
la diseminación de la enfermedad, sin importar qué
tan alejados están los sitios de las zonas endémicas4.
Los animales aceptados hasta el momento como portadores
tienen en muchos casos íntimo contacto con
el hombre, lo que explica la dimensión del problema
que plantea esta zoonosis. Por otra parte, la brucelosis
muestra sintomatología poco definida en los humanos,
por lo que se dificulta la detección precoz del
infectado, lo que favorece la evolución a la cronicidad,
complicando las alternativas terapéuticas y la curación
definitiva4. El espectro clínico diverso de la brucelosis,
sobre todo en la forma crónica, puede hacer que el
diagnóstico se pase por alto o se retarde si el médico
no tiene la sospecha de su existencia. El diagnóstico
definitivo de la brucelosis humana se basa en el aislamiento
de la bacteria3,4. Sin embargo, la proporción
de cultivos positivos varía entre 15 y 85%5,6. La Norma
Oficial Mexicana 022-SS2-1994, para la prevención y
control de la brucelosis en el hombre en el primer nivel
de atención, establece el diagnóstico serológico de
la brucelosis por medio de los métodos de RB, MAP
y con 2-ME, además de las pruebas confirmatorias
como el hemocultivo o mielocultivo positivos7.
Se ha demostrado que las técnicas moleculares
presentan gran sensibilidad y especificidad para la
detección de Brucella en diversas muestras biológicas
(sangre, médula, leche, orina, etc.)8,9. La prueba
de PCR toma un protagonismo para el diagnóstico
rápido y eficiente, dejando al aislamiento para estudios
epidemiológicos9,10. Para utilizarse de rutina en
laboratorios de diagnóstico, la técnica debe validarse,
es decir, evaluar la prueba, con muestras clínicas, los
aspectos de sensibilidad, especificidad y control de
calidad11. En este trabajo se planteó el objetivo de
evaluar la prueba PCR en cuanto a su sensibilidad
y especificidad, para la detección de Brucella spp,
en muestras de sangre humana, comparada con los
métodos serológicos y el hemocultivo.
Material y métodos
Sitios de muestreo
El estudio se realizó en los municipios de Anáhuac
y Sabinas Hidalgo, en el estado de N.L.; los cuales
fueron identificados y seleccionados con base en los
brotes de brucelosis humana ahí sucedidos y reportados
por la Secretaría de Salud del gobierno del estado
en el año 2005.
223 bp of the coding sequence for a protein of 31 kDa present in all Brucella species. Results: The polymerase chain reaction
test detected 23 positive samples. The sensitivity and specificity compared with RB was 44.68 and 95.56%, respectively.
Compared with mouse antibody production, it was 51.61 and 88.52%, and 2-mercaptoethanol was 53.57 and 87.50%. When
isolation (positives cultures) was compared with polymerase chain reaction, we obtained 100.0% sensitivity and 80.23%
specificity, taking into account people with positive and negative serology. Conclusions: The polymerase chain reaction test
can be an alternative tool to bacterial culture in human brucellosis diagnosis. (Gac Med Mex. 2015;151:620-7)
Corresponding author: Alberto Morales-Loredo., amorales@lcrn.mx
KEY WORDS: Brucella spp. PCR. Serology.
Gaceta Médica de México. 2015;151
622
Tamaño de la muestra
El tamaño de la muestra fue determinado mediante
la siguiente fórmula: n = 3.84p (1-p)/T2; donde n es
el tamaño requerido, p esla prevalencia poblacional
desconocida, y T esla cantidad o límites hacia arriba
y hacia abajo de P en puntos porcentuales; en otras
palabras, el grado de precisión en la estimación y
nivel de confianza, 100 (1-a)%12. En este caso se
consideró una prevalencia de 0.0345 para el estado
de N.L. reportada en el año 199213. Considerando
un nivel de confianza de 95% (T = 0.05) y aplicando
la fórmula, el tamaño de muestra (n) fue de 51. Considerando
que el valor de prevalencia utilizado para
cálculo de tamaño de muestra fue de un reporte del
año 1992, se incrementó a 92 muestras analizadas
en este estudio13.
Población estudiada
Se incluyeron en el estudio 92 individuos de los
distintos estratos socioeconómicos, que incluyeron
personas con síntomas, además de personas con ausencia
de síntomas pero que convivieron con personas
enfermas de los asentamientos rurales relacionados
con el brote de brucelosis humana.
Tipo de muestra
Se utilizó sangre completa para hemocultivo y PCR.
Suero para las pruebas serológicas. La toma de la
muestra la efectuó personal de la Secretaría de Salud,
se extrajeron de cada paciente 10 ml de sangre completa
y se dividieron en 2 partes: 5 ml sin EDTA (para
suero) y 5 ml con EDTA.
Análisis serológico y aislamiento
Las pruebas de RB, MAP y la microaglutinación
en presencia de 2-ME se realizaron de acuerdo
a lo descrito por la NOM 022-SSA-1994 (2000).
Además, se inocularon 3 ml de sangre de cada
individuo en el medio bifásico de Ruiz Castañeda
modificado, para realizar el aislamiento mediante
el hemocultivo.
Métodos moleculares
Como control positivo se utilizó ADN de la cepa
vacunal Rev1 de Brucella melitensis en las reacciones
de PCR.
Extracción de ADN a partir
de aislados de hemocultivo,
cepa control y muestras
por el método CTAB
Se tomó una asada de la colonia y se depositó
en tubos Eppendorf® de 1.5 ml de capacidad, se le
adicionaron 400 μl de TE 1X pH 8.0 (10 mM Tris-HCl,
1 mM EDTA) y se inactivaron a 95 °C por 20 minutos.
Posteriormente, la extracción se realizó por el método
de Wilson 1993 modificado14. Para la extracción
del ADN bacteriano a partir de glóbulos blancos, se
tomaron 400 μl de sangre completa y se depositaron
por separado en tubos Eppendorf®, se les adicionaron
900 μl de TE 1X pH 8.0 (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA), se centrifugaron a 10,000 rpm/5 min en una
microcentrífuga SIGMA®, se decantó el sobrenadante
y el botón obtenido fue utilizado para la extracción
de ADN.
Condiciones de amplificación
de la PCR
Se utilizaron los iniciadores que amplifican parte del
gen que codifica para una proteína inmunogénica de
31 KDa de la membrana externa de Brucella abortus
(BCSP31) reportados por Bayle, et al., 1992, las secuencias
B4 (5’-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3’) y
B5 (5’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’) amplifican
un fragmento de 223 pares de bases (pb). La BCSP31
es específica del género Brucella y está conservada
en B. abortus, B. melitensis y B. suis15.
Las reacciones de PCR se realizaron en volúmenes
de 25 μl, en un termociclador PCR Express
(Hybaid Thermo, Middlesex, Reino Unido). La mezcla
de PCR contenía 25 pmoles de cada uno de
los iniciadores, 200 mM de cada uno de los cuatro
desoxinucleósidos trifosfatados (Bioline, Inc., Randolph,
MA EE.UU.), 1.0 mM MgCl2, 1 X de regulador
de reacción (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM
MgCl2 pH 8.3), 2.5 U de Taq DNA polimerasa (Roche
® Applied Science), aproximadamente 100 ng
de ADN molde y agua desionizada para un volumen
final de 25 μl.
La mezcla de reacción se sometió a las condiciones
de ciclos térmicos siguientes: un ciclo de desnaturalización
inicial a 93 °C por 2 min, seguido de 35 ciclos
de tres pasos: desnaturalización a 93 °C durante 60 s,
alineamiento de iniciadores a 60 °C durante 30 s y una
extensión a 72 °C durante 30 s. Con una extensión final
a 72 °C durante 10 min.
M.G. Álvarez-Ojeda, et al.: Comparación de pruebas para brucelosis
623
Electroforesis en gel de agarosa
Los fragmentos amplificados fueron analizados
mediante electroforesis en gel de agarosa (Promega,
Inc.) al 1.5%; en una solución regulador TBE
(Tris base 445 mM, ácido bórico 445 mM, EDTA
10 mM), teñido con bromuro de etidio (10 μg/ml).
Se depositaron 8 μl de cada muestra (amplicón)
mezclado con 2 μl de solución amortiguadora de
carga (0.25% P/V azul de bromofenol, 0.25% P/V
xilencianol, 30% P/V glicerol pH 8.0). Como marcador
de peso molecular se empleó el de 100 pb de
ADN (Bioline). La migración fue a 100 V por una hora.
Los productos de amplificación se visualizaron con un
transiluminador UV (Spectroline Transiluminador, modelo
7C-254R Electronics Corporation, en Westbury, Nueva
York, EE.UU.) bajo luz UV. Las imágenes se capturaron
con una cámara Polaroid y película A667 adaptada
con filtro para luz ultravioleta (Figs. 1 y 2).
Análisis estadístico
Para determinar la utilidad de la PCR en el diagnóstico
de la brucelosis, aquella se comparó con los
resultados de las pruebas de hemocultivo, RB, MAP y
2-ME como pruebas oficiales (NOM-022-SSA2-1994).
La sensibilidad y especificidad relativa de las pruebas
se calculó por medio de la tabla de contingencia
de dos filas por dos columnas; así se comparó la
PCR (variable en filas) y la serología y hemocultivo
(variable en columnas). Además se emplearon las
fórmulas reportadas16, de acuerdo a los siguientes
conceptos: la sensibilidad relativa es la capacidad
del método alternativo para detectar el organismo
blanco comparado con el método de referencia (serología
y hemocultivo). La especificidad relativa es
la capacidad de la PCR de no detectar al organismo
blanco cuando este no es detectado por el método
de referencia.
Además se utilizó la prueba de índice de Kappa
para evaluar el nivel de concordancia entre las
pruebas17. Todos los análisis estadísticos se analizaron
con el programa OpenEpi v3.
Figura 1. Electroforesis de las amplificaciones del ADN de las muestras
de sangre humana. Panel A y B: Carriles 1 a 7, muestras de sangre;
carril 8, control positivo (Cepa Rev1), carril 9, control negativo (agua)
y carril 10, marcador de peso molecular (Ladder 100).
Figura 2. Electroforesis de las amplificaciones de los aislados de
hemocultivo. Carriles 1 a 6 cepas aisladas, carril 7 control negativo
(agua), carril 8 control positivo (ADN de cepa Rev1) y carril 9 marcador
de peso molecular (Ladder 100).
Gaceta Médica de México. 2015;151
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Resultados
Pruebas serológicas
De las 92 muestras analizadas, empleando los métodos
serológicos para el diagnóstico de la brucelosis,
se obtuvieron resultados positivos en 47, 31 y 28 para
RB, MAP y 2-ME, respectivamente (Tabla 1).
Reacciones de PCR a partir del ADN
de las muestras de sangre y hemocultivo
El ADN de 92 muestras sanguíneas humanas provenientes
de individuos relacionados con el brote de
brucelosis humana de los municipios de Anáhuac y Sabinas
Hidalgo, N.L., fueron analizadas por medio de la
PCR; 23 de las muestras (Tabla 1) mostraron claramente
la amplificación del fragmento esperado de 223 pb.
La prueba de PCR, a partir de muestras de sangre
provenientes de individuos relacionados con el brote
de brucelosis humana, permitió detectar un 25%
(23/92) de muestras positivas a diferencia de la prueba
de RB que detectó un 51%, MAP un 33.70%, 2-ME un
30.43% y el hemocultivo un 6.52% (Tabla 1).
Hemocultivo
Brucella spp fue aislada en 6 hemocultivos de las
92 muestras de sangre colectadas. Los aislamientos
fueron confirmados por el Instituto de Diagnóstico y
Referencia Epidemiológicos como B. melitensis. Estas
muestras fueron positivas para PCR y para serología
en todos los métodos.
Comparación análisis de concordancia
de la PCR con las pruebas serológicas
y hemocultivo
Mediante el análisis de contingencia realizado para
cada una de las pruebas serológicas y el hemocultivo
versus la técnica de PCR, se obtuvieron los siguientes
resultados: al comparar la PCR con la prueba RB, la
PCR mostró un 44.68% de sensibilidad, 95.56% de
especificidad y una leve concordancia (0.398). Cuando
se comparó PCR con MAP se obtuvieron 51.61 y
88.52% de sensibilidad y especificidad, además de
una moderada concordancia (0.429). Al comparar la
PCR con 2-ME se obtuvo un 53.57 y 87.50% de sensibilidad
y especificidad respectivamente, además de
una moderada concordancia (0.432). Al comparar la
PCR con el hemocultivo, la PCR obtuvo un 100.0%
de sensibilidad, 80.23% de especificidad y una leve
concordancia (0.346) (Tabla 2).
De las 92 muestras analizadas no se consiguieron
datos sobre el cuadro clínico de los pacientes, además
se desconocía si la muestra había sido tomada
cuando el paciente estaba bajo tratamiento, si era
la primera vez que se presentaba la infección o si
Tabla 1. Resultados serológicos, de hemocultivos y PCR de las muestras analizadas de los municipios de Anáhuac y Sabinas
Hidalgo, N.L.
Prueba
Resultado RB MAP 2-ME Hemocultivo PCR
Positivo 47 (51%) 31 (33.70%) 28 (30.43%) 6 (6.52%) 23 (25%)
Negativo 45 (49%) 61 (66.30%) 64 (69.57%) 86 (93.48%) 69 (75%)
Total de sueros 92 92 92 92 92
RB: rosa de Bengala; MAP: aglutinación estándar en placa; 2-ME: 2 mercaptoetanol.
Tabla 2. Resultados de sensibilidad, especificidad de PCR e índices Kappa para las muestras de estudio
Parámetro RB MAP 2-ME Hemocultivo
Sensibilidad 44.68% 51.61% 53.57% 100.0%
Especificidad 95.56% 88.52% 81.16% 80.23%
Índice Kappa 0.398 0.429 0.432 0.346
RB: rosa de Bengala; MAP: aglutinación estándar en placa; 2-ME: 2 mercaptoetanol.
M.G. Álvarez-Ojeda, et al.: Comparación de pruebas para brucelosis
625
el paciente estaba sufriendo recaídas, debido a que
estos pacientes fueron visitados en sus ranchos y esta
población no realiza visitas constantes al centro médico
de salud.
Análisis comparativo de pruebas
diagnósticas para brucelosis
Los resultados de las muestras de los municipios de
Anáhuac y Sabinas Hidalgo, N.L., nos indican que se
obtuvieron 47 muestras positivas por RB, 31 por MAP,
28 por 2-ME y 6 por aislamiento. Para PCR, solamente
se obtuvieron 23 muestras positivas, cada uno de estos
resultados fue agrupado en 11 casos, los cuales
se muestran en la tabla 3.
Discusión
Algunos estudios realizados han demostrado que
cuando la infección está establecida en forma endémica
en la zona, prácticamente todas las personas
tienen o han tenido contacto con el patógeno, sin que
necesariamente muestren síntomas, como fue el caso
de los 13 individuos del grupo 1 en donde 13 pacientes
resultaron RB positivos, y el resto de las pruebas
negativas. La presencia de anticuerpos puestos de
manifiesto con la prueba de RB muestra que alguna
vez esos individuos se infectaron y han permanecido
positivos. Este hallazgo fue puesto de manifiesto en la
encuesta seroepidemiológica nacional efectuada en el
país en individuos aparentemente sanos13.
En el grupo 2, 2 pacientes resultaron (+) para PCR
y (–) para serología y hemocultivo, posiblemente la
muestra se tomó en una fase temprana de la enfermedad
y/o el individuo cursaba una infección con muy
pocas bacterias circulantes, por lo que no se aisló
Brucella y si este individuo resolvió la infección pronto
no se indujo la formación de anticuerpos4,18.
En algunos casos se ha visto que el aislamiento y
la identificación del agente etiológico no siempre es
posible, sobre todo en algunas formas clínicas de la
enfermedad, y que los cultivos de sangre pueden ser
negativos cuando no hubo una fase aguda aparente
o cuando en esta no se estableció el diagnóstico4,7,19.
Por otro lado, las pruebas serológicas presuntiva y
confirmatorias indican ser negativas ya que no se presentó
una reacción antígeno-anticuerpo, por lo que
no se consideró como caso positivo. La prueba RB
puede ser negativa en personas que tienen pocos
días de evolución o con enfermedad crónica. Es relevante
mencionar que la prueba puede resultar positiva
aun después del tratamiento y la recuperación
del enfermo, incluso hasta por años, por lo que en
forma aislada y sin contar con antecedentes clínicos
es de poco valor. Sin embargo, en el grupo 4, fue
positiva junto con la PCR, lo que sugiere realizar un
Tabla 3. Asociación de resultados de las pruebas serológicas, PCR y hemocultivo
N.o de grupo RB MAP 2-ME Hemocultivo PCR Cantidad de muestras
1 + – – – – 13
2 – – – – + 2
3 + + – – + 1
4 + – – – + 5
5 + + + – + 9
6 – – – – – 41
7 + + + – – 12
8 – + – – – 1
9 – + + – – 1
10 + + – – – 1
11 + + + + + 6
TOTAL 92
RB: rosa de Bengala; MAP: aglutinación estándar en placa; 2–ME: 2 mercaptoetanol.
Gaceta Médica de México. 2015;151
626
análisis del estado clínico y se vuelva a realizar el
hemocultivo de los pacientes, para en caso de tener
aislamiento iniciar un tratamiento para el control de la
brucelosis20. Un paciente resultó (+) PCR, (+) RB, (+)
MAP, y 2-ME y hemocultivo negativos. El hemocultivo
fue negativo posiblemente debido a que la cantidad
de sangre fue insuficiente, los autores recomiendan de
5 a 10 ml por botella. Otros investigadores han visto
que los hemocultivos no siempre resultan positivos
cuando la serología es positiva debido a que Brucella
debe estar viable y en una concentración suficiente y
requiere de un período de incubación prolongado, ya
que es una bacteria de lento crecimiento21. Por otra
parte, se presentó una reacción antígeno-anticuerpo
en RB, y se confirmó con MAP, por lo que el paciente
tenía anticuerpos aglutinantes IgM. Posiblemente la
infección se encontraba en etapa inicial, ya que los
anticuerpos IgM son los que se generan en el comienzo
de la enfermedad y van decreciendo en un lapso
de 3-6 meses, con o sin curación de la enfermedad7.
Cuando se obtuvieron los resultados PCR (+), RB (+),
MAP (–), 2-ME (–) y hemocultivo (–) probablemente
se debió a que se encontró el patógeno en sangre
y fue detectado por la PCR. La serología presuntiva
positiva se debió a una reacción antígeno-anticuerpo,
lo que indica que en estos pacientes hay producción
de anticuerpos específicos19.
Los resultados PCR (+), RB (+), MAP (+), 2-ME (+)
y hemocultivo (–) obtenidos en 9 pacientes nos confirmaron
la presencia de ADN de Brucella en sangre, sin
embargo no fue posible aislar la bacteria, probablemente
debido a que hubo bajos niveles de Brucella en
circulación sanguínea al momento de hacer la toma de
sangre. Además cuando el paciente presenta la enfermedad
en etapa crónica o focal existen pocas bacterias
en circulación, por lo que se dificulta el aislamiento22.
El grupo de 41 pacientes que resultaron negativos
a todas las pruebas representaron a los verdaderos
negativos, ya que las muestras fueron tomadas al azar,
de pacientes con síntomas y sin síntomas.
Por otra parte en áreas donde la enfermedad es
endémica, las pruebas serológicas a menudo dan resultados
positivos aun en ausencia de síntomas, es
decir, que los anticuerpos no sólo aparecen en el
suero de enfermos brucelósicos en el transcurso de
esta enfermedad y su convalecencia; sino que también
se les encuentra en individuos aparentemente sanos
que cursan la infección subclínica o inaparente. Por
consiguiente, las pruebas serológicas tienen un valor
limitado para el diagnóstico de la brucelosis en el
origen del brote, como fue el caso del grupo de 12
individuos en los que la PCR fue (-), RB (+), MAP (+),
2-ME (+) y hemocultivo (-). Mientras que las pruebas
serológicas presuntiva y confirmatorias resultaron positivas,
ya que se presentaron las titulaciones de valor
diagnóstico señaladas para cada prueba19,21.
Por otra parte la prueba RB detecta la presencia de
anticuerpos aglutinantes como la IgM, IgG e IgA en los
primeros días en los que se presentan los síntomas de
la enfermedad. Elfaki, 2005, concluyó que la terapia
con antibiótico limita la presencia de anticuerpos IgM
Brucella-específicos, pero no elimina los anticuerpos
IgG residuales de los pacientes tratados22,23. Con respecto
a los resultados obtenidos por las serologías
confirmatorias, se requiere conocer los antecedentes
del enfermo y valorar las características clínicas.
Los resultados de PCR (+), RB (+), MAP (+), 2-ME
(+) y hemocultivo (+), obtenidos en 6 pacientes, indican
que la PCR detectó al patógeno en sangre en
nuestro estudio. La PCR se ha utilizado en pacientes
detectando otras secuencias como las del RNA ribosomal
(16S y 23S) y de genes que codifican las proteínas
Omp25 y Omp3124,25, e incluso se ha utilizado
para diferenciar especies de Brucella. En un estudio
realizado por Morata, et al.26 se demostró que la PCR
combinada con ELISA alcanzó una sensibilidad hasta
del 94.9% y una especificidad del 96.5%, por lo que
se ha recomendado como el método diagnóstico de
elección. Así mismo se ha demostrado que la PCR
no sólo es útil como un recurso de diagnóstico, sino
que también tiene implicaciones pronósticas, ya que
puede ser utilizada en evaluar la respuesta terapéutica;
recientemente Vrioni, et al.8 lograron demostrar
por medio de PCR en tiempo real que el DNA de B.
melitensis persiste a pesar de existir curación clínica,
esto explica la razón de las recidivas de la enfermedad
y plantearía la posibilidad de que la brucelosis una vez
adquirida, permanece como una infección latente8,27.
El diagnóstico definitivo se basa en el aislamiento de
la Brucella en cultivos de sangre, médula ósea, hígado
y otros tejidos. El desarrollo del microorganismo en el
medio bifásico de Ruiz Castañeda habitualmente ocurre
entre los siete y veintiún días, aunque existen casos
de crecimiento tardío que pueden llegar hasta los
35 días6,25; este método es uno de los más utilizados,
aunque tiene la desventaja de que la bacteria crece
lentamente. A medida que la enfermedad progresa,
disminuye la probabilidad de positividad de los hemocultivos,
por lo que se hace necesario el aislamiento a
partir de ganglios linfáticos, hígado o bazo8.
Finalmente, se logró detectar 23 muestras positivas
provenientes de individuos de los municipios de Anáhuac
M.G. Álvarez-Ojeda, et al.: Comparación de pruebas para brucelosis
627
y Sabinas Hidalgo, N.L. mediante PCR, 21/23 muestras
coincidieron con una o varias pruebas serológicas positivas.
Las pruebas serológicas (RB, MAP y 2-ME) detectaron
un porcentaje mayor de resultados positivos
comparados con PCR y se confirmó la prueba de RB
como la mejor prueba de escrutinio para brucelosis.
Tomando como pruebas de referencia MAP y 2-ME,
según la NOM 022-SSA2-1994 en la identificación de
humanos positivos a brucelosis, estas resultaron superiores
en un 8.7 y 7.43% comparadas con la PCR, respectivamente.
La PCR con respecto a los métodos RB,
MAP, 2-ME y aislamiento obtuvo valores de sensibilidad
desde 44.68 a 100.0% y de especificidad de 80.23 a
95.56%, respectivamente. Además, se obtuvo una moderada
concordancia entre la PCR y las pruebas serológicas
(MAP y 2-ME), sin embargo, la PCR con respecto
al hemocultivo y RB tuvieron una leve concordancia.
La PCR presentó una sensibilidad de100.0% cuando
se comparó con hemocultivo, lo que nos indicó
el gran valor de la prueba molecular para utilizarse
en la detección del patógeno en la sangre humana.
En cuanto a la especificidad (80.23%), fue más baja
que la sensibilidad, esto puede ser debido al difícil
aislamiento de la bacteria en sangre, por la escasa
cantidad circulante al momento de obtener la muestra
para el hemocultivo.
Agradecimientos
A la Fundación Produce Nuevo León, A. C. por financiamiento
de esta investigación. Al personal del Laboratorio
Central Regional del Norte, dependiente de la
Unión Ganadera Regional de Nuevo León., así como
al del Laboratorio Estatal de los Servicios de Salud en
el estado de Nuevo León, en donde se desarrollaron
los trabajos de laboratorio.
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