Uso de la prueba de PCR para el diagnóstico de brucelosis en comunidades rurales de Nuevo León dedicadas a la producción caprina.

GACETA MÉDICA DE MÉXICO ARTÍCULO ORIGINAL
Correspondencia:
*Alberto Morales-Loredo
Universidad Autónoma de Nuevo León, UANL, CDA.
Francisco Villa s/n. Nte.
Col. Ex Hacienda El Canadá, C.P. 66054
Gral. Escobedo, N.L., México
E-mail: amorales@lcrn.mx

Fecha de recepción: 22-09-2014
Fecha de aceptación: 13-01-2015
PERMANYER
www.permanyer.com
Contents available at PubMed
www.anmm.org.mx Gac Med Mex. 2015;151:620-7
Resumen
Objetivo: Comparar la prueba PCR, para la detección de Brucella spp, en muestras de sangre humana, con respecto a rosa
de Bengala (RB), aglutinación estándar en placa (MAP), 2-mercaptoetanol (2-ME) y hemocultivo establecidas en la NOM
022-SS2-1994, en cuanto a sensibilidad y especificidad. Material y métodos: En el año 2005, se muestreó a 92 personas de
los municipios de Anáhuac y Sabinas Hidalgo, Nuevo León (N.L.), en donde se registró un brote de brucelosis en humanos.
A partir de sangre completa, se realizó el hemocultivo y se obtuvo ADN. Se amplificó un fragmento de 223 pares de bases
de la secuencia que codifica para una proteína de 31 kDa específica del género Brucella. Resultados: La PCR detectó
23 muestras positivas. La sensibilidad y especificidad de PCR comparada con RB fue de 44.68 y 95.56%, respectivamente.
Comparada con MAP fue de 51.61 y 88.52%, mientras que con 2-ME fue de 53.57 y 87.50%. Cuando se comparó con el
aislamiento bacteriano, se obtuvo un 100.0% de sensibilidad y 80.23% de especificidad considerando tanto personas
positivas como negativas para serología. Conclusiones: La prueba de PCR puede ser una herramienta alternativa al cultivo
bacteriano, en el diagnóstico de brucelosis humana.
PALABRAS CLAVE: Brucella spp. PCR. Serología.
Abstract
Objective: The aim of this study was to evaluate the sensitivity and specificity of polymerase chain reaction for detection of
Brucella spp in human blood samples compared with the serological tests and blood culture. Material and Methods: In 2005,
a total of 92 people were sampled from the towns of Anahuac and Sabinas Hidalgo, Nuevo Leon, where an outbreak of
human cases had taken place in the same year as this study. The sera collected were analyzed by serological tests according
to the NOM 022-SS2-1994. DNA was obtained using CTAB extraction method and it was used to amplify a fragment of
M.G. Álvarez-Ojeda, et al.: Comparación de pruebas para brucelosis
621
Introducción
La brucelosis es una enfermedad infecciosa producida
por bacterias del género Brucella, que se caracterizan
por ser patógenos intracelulares facultativos.
Es una clásica zoonosis (antropozoonosis) que ocasiona
problemas de salud entre los individuos que ingieren
alimentos provenientes de animales infectados
y representa un riesgo ocupacional para las personas
que trabajan o mantienen un estrecho contacto con el
ganado infectado. La enfermedad es de distribución
mundial y es endémica en algunos países, donde representa
un importante problema de salud pública1.
El control de la enfermedad en animales tiene un gran
impacto en la reducción de la incidencia en humanos2.
La incidencia de brucelosis en la población humana
de México es oscilatoria, con una variación temporal,
dependiente de la entidad. La Dirección General de
Epidemiología de la Secretaría de Salud notificó 2,073
casos confirmados en el año 2010. Los estados con
mayor incidencia fueron: Sonora con 248, Guanajuato
con 317, Jalisco con 179, N.L. con 154 y Michoacán
con 145 casos3. Del año 2000 al 2009, los registros
de nuevos casos de brucelosis en humanos, a nivel
nacional, muestran cómo la tasa de incidencia de 1.66
reportada en 2006 se incrementó a 2.38/100,000 habitantes
en 20103.
En países como el nuestro, el riesgo de adquirir la
infección en el humano está en correlación con los hábitos
higiénicos y alimenticios. La movilización de lácteos
hacia las zonas urbanas, como parte del proceso de
comercialización, ha contribuido en buena medida a
la diseminación de la enfermedad, sin importar qué
tan alejados están los sitios de las zonas endémicas4.
Los animales aceptados hasta el momento como portadores
tienen en muchos casos íntimo contacto con
el hombre, lo que explica la dimensión del problema
que plantea esta zoonosis. Por otra parte, la brucelosis
muestra sintomatología poco definida en los humanos,
por lo que se dificulta la detección precoz del
infectado, lo que favorece la evolución a la cronicidad,
complicando las alternativas terapéuticas y la curación
definitiva4. El espectro clínico diverso de la brucelosis,
sobre todo en la forma crónica, puede hacer que el
diagnóstico se pase por alto o se retarde si el médico
no tiene la sospecha de su existencia. El diagnóstico
definitivo de la brucelosis humana se basa en el aislamiento
de la bacteria3,4. Sin embargo, la proporción
de cultivos positivos varía entre 15 y 85%5,6. La Norma
Oficial Mexicana 022-SS2-1994, para la prevención y
control de la brucelosis en el hombre en el primer nivel
de atención, establece el diagnóstico serológico de
la brucelosis por medio de los métodos de RB, MAP
y con 2-ME, además de las pruebas confirmatorias
como el hemocultivo o mielocultivo positivos7.
Se ha demostrado que las técnicas moleculares
presentan gran sensibilidad y especificidad para la
detección de Brucella en diversas muestras biológicas
(sangre, médula, leche, orina, etc.)8,9. La prueba
de PCR toma un protagonismo para el diagnóstico
rápido y eficiente, dejando al aislamiento para estudios
epidemiológicos9,10. Para utilizarse de rutina en
laboratorios de diagnóstico, la técnica debe validarse,
es decir, evaluar la prueba, con muestras clínicas, los
aspectos de sensibilidad, especificidad y control de
calidad11. En este trabajo se planteó el objetivo de
evaluar la prueba PCR en cuanto a su sensibilidad
y especificidad, para la detección de Brucella spp,
en muestras de sangre humana, comparada con los
métodos serológicos y el hemocultivo.
Material y métodos
Sitios de muestreo
El estudio se realizó en los municipios de Anáhuac
y Sabinas Hidalgo, en el estado de N.L.; los cuales
fueron identificados y seleccionados con base en los
brotes de brucelosis humana ahí sucedidos y reportados
por la Secretaría de Salud del gobierno del estado
en el año 2005.
223 bp of the coding sequence for a protein of 31 kDa present in all Brucella species. Results: The polymerase chain reaction
test detected 23 positive samples. The sensitivity and specificity compared with RB was 44.68 and 95.56%, respectively.
Compared with mouse antibody production, it was 51.61 and 88.52%, and 2-mercaptoethanol was 53.57 and 87.50%. When
isolation (positives cultures) was compared with polymerase chain reaction, we obtained 100.0% sensitivity and 80.23%
specificity, taking into account people with positive and negative serology. Conclusions: The polymerase chain reaction test
can be an alternative tool to bacterial culture in human brucellosis diagnosis. (Gac Med Mex. 2015;151:620-7)
Corresponding author: Alberto Morales-Loredo., amorales@lcrn.mx
KEY WORDS: Brucella spp. PCR. Serology.
Gaceta Médica de México. 2015;151
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Tamaño de la muestra
El tamaño de la muestra fue determinado mediante
la siguiente fórmula: n = 3.84p (1-p)/T2; donde n es
el tamaño requerido, p esla prevalencia poblacional
desconocida, y T esla cantidad o límites hacia arriba
y hacia abajo de P en puntos porcentuales; en otras
palabras, el grado de precisión en la estimación y
nivel de confianza, 100 (1-a)%12. En este caso se
consideró una prevalencia de 0.0345 para el estado
de N.L. reportada en el año 199213. Considerando
un nivel de confianza de 95% (T = 0.05) y aplicando
la fórmula, el tamaño de muestra (n) fue de 51. Considerando
que el valor de prevalencia utilizado para
cálculo de tamaño de muestra fue de un reporte del
año 1992, se incrementó a 92 muestras analizadas
en este estudio13.
Población estudiada
Se incluyeron en el estudio 92 individuos de los
distintos estratos socioeconómicos, que incluyeron
personas con síntomas, además de personas con ausencia
de síntomas pero que convivieron con personas
enfermas de los asentamientos rurales relacionados
con el brote de brucelosis humana.
Tipo de muestra
Se utilizó sangre completa para hemocultivo y PCR.
Suero para las pruebas serológicas. La toma de la
muestra la efectuó personal de la Secretaría de Salud,
se extrajeron de cada paciente 10 ml de sangre completa
y se dividieron en 2 partes: 5 ml sin EDTA (para
suero) y 5 ml con EDTA.
Análisis serológico y aislamiento
Las pruebas de RB, MAP y la microaglutinación
en presencia de 2-ME se realizaron de acuerdo
a lo descrito por la NOM 022-SSA-1994 (2000).
Además, se inocularon 3 ml de sangre de cada
individuo en el medio bifásico de Ruiz Castañeda
modificado, para realizar el aislamiento mediante
el hemocultivo.
Métodos moleculares
Como control positivo se utilizó ADN de la cepa
vacunal Rev1 de Brucella melitensis en las reacciones
de PCR.
Extracción de ADN a partir
de aislados de hemocultivo,
cepa control y muestras
por el método CTAB
Se tomó una asada de la colonia y se depositó
en tubos Eppendorf® de 1.5 ml de capacidad, se le
adicionaron 400 μl de TE 1X pH 8.0 (10 mM Tris-HCl,
1 mM EDTA) y se inactivaron a 95 °C por 20 minutos.
Posteriormente, la extracción se realizó por el método
de Wilson 1993 modificado14. Para la extracción
del ADN bacteriano a partir de glóbulos blancos, se
tomaron 400 μl de sangre completa y se depositaron
por separado en tubos Eppendorf®, se les adicionaron
900 μl de TE 1X pH 8.0 (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA), se centrifugaron a 10,000 rpm/5 min en una
microcentrífuga SIGMA®, se decantó el sobrenadante
y el botón obtenido fue utilizado para la extracción
de ADN.
Condiciones de amplificación
de la PCR
Se utilizaron los iniciadores que amplifican parte del
gen que codifica para una proteína inmunogénica de
31 KDa de la membrana externa de Brucella abortus
(BCSP31) reportados por Bayle, et al., 1992, las secuencias
B4 (5’-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3’) y
B5 (5’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’) amplifican
un fragmento de 223 pares de bases (pb). La BCSP31
es específica del género Brucella y está conservada
en B. abortus, B. melitensis y B. suis15.
Las reacciones de PCR se realizaron en volúmenes
de 25 μl, en un termociclador PCR Express
(Hybaid Thermo, Middlesex, Reino Unido). La mezcla
de PCR contenía 25 pmoles de cada uno de
los iniciadores, 200 mM de cada uno de los cuatro
desoxinucleósidos trifosfatados (Bioline, Inc., Randolph,
MA EE.UU.), 1.0 mM MgCl2, 1 X de regulador
de reacción (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM
MgCl2 pH 8.3), 2.5 U de Taq DNA polimerasa (Roche
® Applied Science), aproximadamente 100 ng
de ADN molde y agua desionizada para un volumen
final de 25 μl.
La mezcla de reacción se sometió a las condiciones
de ciclos térmicos siguientes: un ciclo de desnaturalización
inicial a 93 °C por 2 min, seguido de 35 ciclos
de tres pasos: desnaturalización a 93 °C durante 60 s,
alineamiento de iniciadores a 60 °C durante 30 s y una
extensión a 72 °C durante 30 s. Con una extensión final
a 72 °C durante 10 min.
M.G. Álvarez-Ojeda, et al.: Comparación de pruebas para brucelosis
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Electroforesis en gel de agarosa
Los fragmentos amplificados fueron analizados
mediante electroforesis en gel de agarosa (Promega,
Inc.) al 1.5%; en una solución regulador TBE
(Tris base 445 mM, ácido bórico 445 mM, EDTA
10 mM), teñido con bromuro de etidio (10 μg/ml).
Se depositaron 8 μl de cada muestra (amplicón)
mezclado con 2 μl de solución amortiguadora de
carga (0.25% P/V azul de bromofenol, 0.25% P/V
xilencianol, 30% P/V glicerol pH 8.0). Como marcador
de peso molecular se empleó el de 100 pb de
ADN (Bioline). La migración fue a 100 V por una hora.
Los productos de amplificación se visualizaron con un
transiluminador UV (Spectroline Transiluminador, modelo
7C-254R Electronics Corporation, en Westbury, Nueva
York, EE.UU.) bajo luz UV. Las imágenes se capturaron
con una cámara Polaroid y película A667 adaptada
con filtro para luz ultravioleta (Figs. 1 y 2).
Análisis estadístico
Para determinar la utilidad de la PCR en el diagnóstico
de la brucelosis, aquella se comparó con los
resultados de las pruebas de hemocultivo, RB, MAP y
2-ME como pruebas oficiales (NOM-022-SSA2-1994).
La sensibilidad y especificidad relativa de las pruebas
se calculó por medio de la tabla de contingencia
de dos filas por dos columnas; así se comparó la
PCR (variable en filas) y la serología y hemocultivo
(variable en columnas). Además se emplearon las
fórmulas reportadas16, de acuerdo a los siguientes
conceptos: la sensibilidad relativa es la capacidad
del método alternativo para detectar el organismo
blanco comparado con el método de referencia (serología
y hemocultivo). La especificidad relativa es
la capacidad de la PCR de no detectar al organismo
blanco cuando este no es detectado por el método
de referencia.
Además se utilizó la prueba de índice de Kappa
para evaluar el nivel de concordancia entre las
pruebas17. Todos los análisis estadísticos se analizaron
con el programa OpenEpi v3.
Figura 1. Electroforesis de las amplificaciones del ADN de las muestras
de sangre humana. Panel A y B: Carriles 1 a 7, muestras de sangre;
carril 8, control positivo (Cepa Rev1), carril 9, control negativo (agua)
y carril 10, marcador de peso molecular (Ladder 100).
Figura 2. Electroforesis de las amplificaciones de los aislados de
hemocultivo. Carriles 1 a 6 cepas aisladas, carril 7 control negativo
(agua), carril 8 control positivo (ADN de cepa Rev1) y carril 9 marcador
de peso molecular (Ladder 100).
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Resultados
Pruebas serológicas
De las 92 muestras analizadas, empleando los métodos
serológicos para el diagnóstico de la brucelosis,
se obtuvieron resultados positivos en 47, 31 y 28 para
RB, MAP y 2-ME, respectivamente (Tabla 1).
Reacciones de PCR a partir del ADN
de las muestras de sangre y hemocultivo
El ADN de 92 muestras sanguíneas humanas provenientes
de individuos relacionados con el brote de
brucelosis humana de los municipios de Anáhuac y Sabinas
Hidalgo, N.L., fueron analizadas por medio de la
PCR; 23 de las muestras (Tabla 1) mostraron claramente
la amplificación del fragmento esperado de 223 pb.
La prueba de PCR, a partir de muestras de sangre
provenientes de individuos relacionados con el brote
de brucelosis humana, permitió detectar un 25%
(23/92) de muestras positivas a diferencia de la prueba
de RB que detectó un 51%, MAP un 33.70%, 2-ME un
30.43% y el hemocultivo un 6.52% (Tabla 1).
Hemocultivo
Brucella spp fue aislada en 6 hemocultivos de las
92 muestras de sangre colectadas. Los aislamientos
fueron confirmados por el Instituto de Diagnóstico y
Referencia Epidemiológicos como B. melitensis. Estas
muestras fueron positivas para PCR y para serología
en todos los métodos.
Comparación análisis de concordancia
de la PCR con las pruebas serológicas
y hemocultivo
Mediante el análisis de contingencia realizado para
cada una de las pruebas serológicas y el hemocultivo
versus la técnica de PCR, se obtuvieron los siguientes
resultados: al comparar la PCR con la prueba RB, la
PCR mostró un 44.68% de sensibilidad, 95.56% de
especificidad y una leve concordancia (0.398). Cuando
se comparó PCR con MAP se obtuvieron 51.61 y
88.52% de sensibilidad y especificidad, además de
una moderada concordancia (0.429). Al comparar la
PCR con 2-ME se obtuvo un 53.57 y 87.50% de sensibilidad
y especificidad respectivamente, además de
una moderada concordancia (0.432). Al comparar la
PCR con el hemocultivo, la PCR obtuvo un 100.0%
de sensibilidad, 80.23% de especificidad y una leve
concordancia (0.346) (Tabla 2).
De las 92 muestras analizadas no se consiguieron
datos sobre el cuadro clínico de los pacientes, además
se desconocía si la muestra había sido tomada
cuando el paciente estaba bajo tratamiento, si era
la primera vez que se presentaba la infección o si
Tabla 1. Resultados serológicos, de hemocultivos y PCR de las muestras analizadas de los municipios de Anáhuac y Sabinas
Hidalgo, N.L.
Prueba
Resultado RB MAP 2-ME Hemocultivo PCR
Positivo 47 (51%) 31 (33.70%) 28 (30.43%) 6 (6.52%) 23 (25%)
Negativo 45 (49%) 61 (66.30%) 64 (69.57%) 86 (93.48%) 69 (75%)
Total de sueros 92 92 92 92 92
RB: rosa de Bengala; MAP: aglutinación estándar en placa; 2-ME: 2 mercaptoetanol.
Tabla 2. Resultados de sensibilidad, especificidad de PCR e índices Kappa para las muestras de estudio
Parámetro RB MAP 2-ME Hemocultivo
Sensibilidad 44.68% 51.61% 53.57% 100.0%
Especificidad 95.56% 88.52% 81.16% 80.23%
Índice Kappa 0.398 0.429 0.432 0.346
RB: rosa de Bengala; MAP: aglutinación estándar en placa; 2-ME: 2 mercaptoetanol.
M.G. Álvarez-Ojeda, et al.: Comparación de pruebas para brucelosis
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el paciente estaba sufriendo recaídas, debido a que
estos pacientes fueron visitados en sus ranchos y esta
población no realiza visitas constantes al centro médico
de salud.
Análisis comparativo de pruebas
diagnósticas para brucelosis
Los resultados de las muestras de los municipios de
Anáhuac y Sabinas Hidalgo, N.L., nos indican que se
obtuvieron 47 muestras positivas por RB, 31 por MAP,
28 por 2-ME y 6 por aislamiento. Para PCR, solamente
se obtuvieron 23 muestras positivas, cada uno de estos
resultados fue agrupado en 11 casos, los cuales
se muestran en la tabla 3.
Discusión
Algunos estudios realizados han demostrado que
cuando la infección está establecida en forma endémica
en la zona, prácticamente todas las personas
tienen o han tenido contacto con el patógeno, sin que
necesariamente muestren síntomas, como fue el caso
de los 13 individuos del grupo 1 en donde 13 pacientes
resultaron RB positivos, y el resto de las pruebas
negativas. La presencia de anticuerpos puestos de
manifiesto con la prueba de RB muestra que alguna
vez esos individuos se infectaron y han permanecido
positivos. Este hallazgo fue puesto de manifiesto en la
encuesta seroepidemiológica nacional efectuada en el
país en individuos aparentemente sanos13.
En el grupo 2, 2 pacientes resultaron (+) para PCR
y (–) para serología y hemocultivo, posiblemente la
muestra se tomó en una fase temprana de la enfermedad
y/o el individuo cursaba una infección con muy
pocas bacterias circulantes, por lo que no se aisló
Brucella y si este individuo resolvió la infección pronto
no se indujo la formación de anticuerpos4,18.
En algunos casos se ha visto que el aislamiento y
la identificación del agente etiológico no siempre es
posible, sobre todo en algunas formas clínicas de la
enfermedad, y que los cultivos de sangre pueden ser
negativos cuando no hubo una fase aguda aparente
o cuando en esta no se estableció el diagnóstico4,7,19.
Por otro lado, las pruebas serológicas presuntiva y
confirmatorias indican ser negativas ya que no se presentó
una reacción antígeno-anticuerpo, por lo que
no se consideró como caso positivo. La prueba RB
puede ser negativa en personas que tienen pocos
días de evolución o con enfermedad crónica. Es relevante
mencionar que la prueba puede resultar positiva
aun después del tratamiento y la recuperación
del enfermo, incluso hasta por años, por lo que en
forma aislada y sin contar con antecedentes clínicos
es de poco valor. Sin embargo, en el grupo 4, fue
positiva junto con la PCR, lo que sugiere realizar un
Tabla 3. Asociación de resultados de las pruebas serológicas, PCR y hemocultivo
N.o de grupo RB MAP 2-ME Hemocultivo PCR Cantidad de muestras
1 + – – – – 13
2 – – – – + 2
3 + + – – + 1
4 + – – – + 5
5 + + + – + 9
6 – – – – – 41
7 + + + – – 12
8 – + – – – 1
9 – + + – – 1
10 + + – – – 1
11 + + + + + 6
TOTAL 92
RB: rosa de Bengala; MAP: aglutinación estándar en placa; 2–ME: 2 mercaptoetanol.
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análisis del estado clínico y se vuelva a realizar el
hemocultivo de los pacientes, para en caso de tener
aislamiento iniciar un tratamiento para el control de la
brucelosis20. Un paciente resultó (+) PCR, (+) RB, (+)
MAP, y 2-ME y hemocultivo negativos. El hemocultivo
fue negativo posiblemente debido a que la cantidad
de sangre fue insuficiente, los autores recomiendan de
5 a 10 ml por botella. Otros investigadores han visto
que los hemocultivos no siempre resultan positivos
cuando la serología es positiva debido a que Brucella
debe estar viable y en una concentración suficiente y
requiere de un período de incubación prolongado, ya
que es una bacteria de lento crecimiento21. Por otra
parte, se presentó una reacción antígeno-anticuerpo
en RB, y se confirmó con MAP, por lo que el paciente
tenía anticuerpos aglutinantes IgM. Posiblemente la
infección se encontraba en etapa inicial, ya que los
anticuerpos IgM son los que se generan en el comienzo
de la enfermedad y van decreciendo en un lapso
de 3-6 meses, con o sin curación de la enfermedad7.
Cuando se obtuvieron los resultados PCR (+), RB (+),
MAP (–), 2-ME (–) y hemocultivo (–) probablemente
se debió a que se encontró el patógeno en sangre
y fue detectado por la PCR. La serología presuntiva
positiva se debió a una reacción antígeno-anticuerpo,
lo que indica que en estos pacientes hay producción
de anticuerpos específicos19.
Los resultados PCR (+), RB (+), MAP (+), 2-ME (+)
y hemocultivo (–) obtenidos en 9 pacientes nos confirmaron
la presencia de ADN de Brucella en sangre, sin
embargo no fue posible aislar la bacteria, probablemente
debido a que hubo bajos niveles de Brucella en
circulación sanguínea al momento de hacer la toma de
sangre. Además cuando el paciente presenta la enfermedad
en etapa crónica o focal existen pocas bacterias
en circulación, por lo que se dificulta el aislamiento22.
El grupo de 41 pacientes que resultaron negativos
a todas las pruebas representaron a los verdaderos
negativos, ya que las muestras fueron tomadas al azar,
de pacientes con síntomas y sin síntomas.
Por otra parte en áreas donde la enfermedad es
endémica, las pruebas serológicas a menudo dan resultados
positivos aun en ausencia de síntomas, es
decir, que los anticuerpos no sólo aparecen en el
suero de enfermos brucelósicos en el transcurso de
esta enfermedad y su convalecencia; sino que también
se les encuentra en individuos aparentemente sanos
que cursan la infección subclínica o inaparente. Por
consiguiente, las pruebas serológicas tienen un valor
limitado para el diagnóstico de la brucelosis en el
origen del brote, como fue el caso del grupo de 12
individuos en los que la PCR fue (-), RB (+), MAP (+),
2-ME (+) y hemocultivo (-). Mientras que las pruebas
serológicas presuntiva y confirmatorias resultaron positivas,
ya que se presentaron las titulaciones de valor
diagnóstico señaladas para cada prueba19,21.
Por otra parte la prueba RB detecta la presencia de
anticuerpos aglutinantes como la IgM, IgG e IgA en los
primeros días en los que se presentan los síntomas de
la enfermedad. Elfaki, 2005, concluyó que la terapia
con antibiótico limita la presencia de anticuerpos IgM
Brucella-específicos, pero no elimina los anticuerpos
IgG residuales de los pacientes tratados22,23. Con respecto
a los resultados obtenidos por las serologías
confirmatorias, se requiere conocer los antecedentes
del enfermo y valorar las características clínicas.
Los resultados de PCR (+), RB (+), MAP (+), 2-ME
(+) y hemocultivo (+), obtenidos en 6 pacientes, indican
que la PCR detectó al patógeno en sangre en
nuestro estudio. La PCR se ha utilizado en pacientes
detectando otras secuencias como las del RNA ribosomal
(16S y 23S) y de genes que codifican las proteínas
Omp25 y Omp3124,25, e incluso se ha utilizado
para diferenciar especies de Brucella. En un estudio
realizado por Morata, et al.26 se demostró que la PCR
combinada con ELISA alcanzó una sensibilidad hasta
del 94.9% y una especificidad del 96.5%, por lo que
se ha recomendado como el método diagnóstico de
elección. Así mismo se ha demostrado que la PCR
no sólo es útil como un recurso de diagnóstico, sino
que también tiene implicaciones pronósticas, ya que
puede ser utilizada en evaluar la respuesta terapéutica;
recientemente Vrioni, et al.8 lograron demostrar
por medio de PCR en tiempo real que el DNA de B.
melitensis persiste a pesar de existir curación clínica,
esto explica la razón de las recidivas de la enfermedad
y plantearía la posibilidad de que la brucelosis una vez
adquirida, permanece como una infección latente8,27.
El diagnóstico definitivo se basa en el aislamiento de
la Brucella en cultivos de sangre, médula ósea, hígado
y otros tejidos. El desarrollo del microorganismo en el
medio bifásico de Ruiz Castañeda habitualmente ocurre
entre los siete y veintiún días, aunque existen casos
de crecimiento tardío que pueden llegar hasta los
35 días6,25; este método es uno de los más utilizados,
aunque tiene la desventaja de que la bacteria crece
lentamente. A medida que la enfermedad progresa,
disminuye la probabilidad de positividad de los hemocultivos,
por lo que se hace necesario el aislamiento a
partir de ganglios linfáticos, hígado o bazo8.
Finalmente, se logró detectar 23 muestras positivas
provenientes de individuos de los municipios de Anáhuac
M.G. Álvarez-Ojeda, et al.: Comparación de pruebas para brucelosis
627
y Sabinas Hidalgo, N.L. mediante PCR, 21/23 muestras
coincidieron con una o varias pruebas serológicas positivas.
Las pruebas serológicas (RB, MAP y 2-ME) detectaron
un porcentaje mayor de resultados positivos
comparados con PCR y se confirmó la prueba de RB
como la mejor prueba de escrutinio para brucelosis.
Tomando como pruebas de referencia MAP y 2-ME,
según la NOM 022-SSA2-1994 en la identificación de
humanos positivos a brucelosis, estas resultaron superiores
en un 8.7 y 7.43% comparadas con la PCR, respectivamente.
La PCR con respecto a los métodos RB,
MAP, 2-ME y aislamiento obtuvo valores de sensibilidad
desde 44.68 a 100.0% y de especificidad de 80.23 a
95.56%, respectivamente. Además, se obtuvo una moderada
concordancia entre la PCR y las pruebas serológicas
(MAP y 2-ME), sin embargo, la PCR con respecto
al hemocultivo y RB tuvieron una leve concordancia.
La PCR presentó una sensibilidad de100.0% cuando
se comparó con hemocultivo, lo que nos indicó
el gran valor de la prueba molecular para utilizarse
en la detección del patógeno en la sangre humana.
En cuanto a la especificidad (80.23%), fue más baja
que la sensibilidad, esto puede ser debido al difícil
aislamiento de la bacteria en sangre, por la escasa
cantidad circulante al momento de obtener la muestra
para el hemocultivo.
Agradecimientos
A la Fundación Produce Nuevo León, A. C. por financiamiento
de esta investigación. Al personal del Laboratorio
Central Regional del Norte, dependiente de la
Unión Ganadera Regional de Nuevo León., así como
al del Laboratorio Estatal de los Servicios de Salud en
el estado de Nuevo León, en donde se desarrollaron
los trabajos de laboratorio.
Bibliografía
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